掌握鼠尾膠原蛋白制備方法是保障實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性與生物學(xué)功能的關(guān)鍵

更新時(shí)間：2025-12-02

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　　鼠尾膠原蛋白是從大鼠尾腱中提取的高純度天然膠原，因其結(jié)構(gòu)完整、生物相容性優(yōu)異，被廣泛應(yīng)用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程支架、傷口修復(fù)模型及藥物遞送系統(tǒng)等前沿研究。其制備過(guò)程對(duì)溫度、pH、離子強(qiáng)度及操作潔凈度敏感，稍有偏差即導(dǎo)致變性、降解或凝膠性能異常。掌握鼠尾膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)化、無(wú)菌化的制備方法，是保障實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性與生物學(xué)功能的關(guān)鍵。

　　一、材料與前期準(zhǔn)備

　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用健康成年SD或Wistar大鼠（6–12周齡），尾部無(wú)損傷；

　　試劑：0.1%醋酸溶液（用超純水配制，4℃預(yù)冷）、PBS緩沖液、75%乙醇；

　　器具：無(wú)菌手術(shù)剪/鑷、玻璃勻漿器、離心管、磁力攪拌器、低溫離心機(jī)（4℃）、0.22μm濾器；

　　環(huán)境：全程在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作，所有器具經(jīng)高溫高壓滅菌。

　　二、尾腱分離與清洗

　　處死大鼠后迅速取下整條尾巴，浸入75%乙醇消毒30秒；

　　在冰上剝離皮膚，逐節(jié)剪斷尾椎骨，小心分離白色尾腱束；

　　將尾腱置于預(yù)冷PBS中反復(fù)漂洗，去除血跡與脂肪組織。

　　三、酸溶提取（關(guān)鍵步驟）

　　將洗凈的尾腱剪碎（約1–2mm段），按1g組織:50mL比例加入0.1%冰醋酸溶液；

　　4℃磁力攪拌24–48小時(shí)（避光），使膠原充分溶出；

　　注意：全程保持低溫，防止酶解或熱變性；避免劇烈震蕩產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致蛋白氧化。

　　四、離心與過(guò)濾純化

　　4℃下以10,000–12,000×g離心30分鐘，棄沉淀；

　　上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，得澄清淡黃色膠原溶液；

　　可分裝于無(wú)菌EP管，–20℃或–80℃保存（避免反復(fù)凍融）。

　　五、濃度測(cè)定與質(zhì)量驗(yàn)證

　　羥脯氨酸法或BCA法測(cè)定蛋白濃度（通常為1–3mg/mL）；

　　SDS-PAGE電泳驗(yàn)證α1、α2鏈完整性（典型條帶約130kDa和120kDa）；

　　凝膠形成測(cè)試：將膠原液調(diào)至中性（加10×PBS和NaOH），37℃孵育30分鐘，應(yīng)形成均勻凝膠。